Vaigu täielik paisumine
Kaaluge 2,0 g tühja Wangi vaiku puhtas ja kuivas reaktsioonituubis, lisage 15 ml DMF-i, aktiveerige toatemperatuuril umbes 30 minutit.
Võtke esimene aminohape
Toatemperatuuril filtreerige eelmise etapi lahusti läbi liivasüdamiku ja lisage 1 mmol 5 molaarset liiast C Esimene aminohape lõpus, 5-kordne molaarne liig DMAP, 5 molaarne liig DIC, DMF Lahusti toatemperatuuril reaktsioon 3 h. Kasutage pärast reaktsiooni lõppemist DMF Peske 4-6 korda, iga kord 5-6 korda ml. Seejärel lisage sobiv kogus püridiini ja äädikhappeanhüdriidi mahusuhtega 1:1 ning laske 30 minutit reageerida. Kasutage pärast reaktsiooni lõppemist DMF Peske 4-6 korda, iga kord 5-6 korda ml. (efekt: blokeerige aktiivsed mikropunktid mittereaktiivsel tühjal vaigul.)
Fmoc Kaitserühmade lahkumine
Eemaldage eelmises etapis lahusti vaakumfiltreerimisega ja lisage 10 ml 20% piperidiini DMF Lahus lisatakse vaigule, N2 Segage 10 min Lõpuks filtreerige lahus ja lisage 10 ml 20% piperidiini DMF lahust, N2 Puhuge ja segage 5 minutit Seejärel filtreerige lahus välja ja korrake seda toimingut kaks korda. DMF Pesta 4 korda, 2 korda metanooliga, iga kord 5-6 korda ml.
Ninhüdriini eemaldava toime testimine
Võtke väike kogus vaiku välja, peske kolm korda metanooliga, lisage ninhüdriin, KCN, üks tilk fenoolilahust, 105-110 kraadi Kuumutamine 5 min, Tumesiniseks värvumine on positiivne reaktsioon, mis näitab, et eemaldamine on lõppenud ja saab läbi viia reaktsiooni järgmise etapi. Kui see on värvitu, tähendab see, et kaitserühm ei ole täielikult eemaldatud ja ülaltoodud kaitse eemaldamise toimingut tuleb korrata.
Seejärel teise aminohappe ja Fmoc Protection rühma eemaldamine
Kaaluge 3-kordne molaarne liig C Teine aminohape lõpus, 3-kordne molaarne liig HBTU ja 3-kordne molaarne liig HOBT Reaktsioonitorusse lisage sobiv kogus DMF Kui lahus on täielikult lahustunud, lisage 10-kordne molaarne liig (puhas) DIEA, toatemperatuuril reaktsioon 40 min, kasutage DMF-i pesu 4–6 korda, iga kord 5–6 ml. Kasutage väikest kogust vaiku Testige ninhüdriini tuvastamisreagendiga ja see tundub värvitu, seejärel lisage 10 ml 20% piperidiini DMF Lahuse eemaldamine Fmoc, Tehke seda kaks korda 10 min, 5 min, pärast kasutamist DMF Peske 4 korda, peske 2 korda metanooliga, iga kord 5-6 korda ml. Võtke välja väike kogus vaiku Kasutage selle tuvastamiseks ninhüdriini tuvastamise reaktiivi. Kui tuvastamine on sinine, võite jätkata reaktsiooni järgmise etapiga.
Analoogiliselt korrake samme 2.6, kuni süntees on N. Eemaldage Fmoc Protecti aluse lõpust viimane aminohape, seejärel tühjendage.
Vaigu eemaldamine ja puhta toote eraldamine ja tuvastamine
Lõpuks kasutage trifluoroäädikhappe lõikamislahust (95% TFA: 2% TIS: 2% EDT: 1% H2O) Lõika 2 tundi, filtreerige reaktsioonilahus vaakumfiltriga ja hankige polüpeptiidi trifluoroäädikhappe lahus. Lüsaat kuivatatakse nii palju kui võimalik lämmastikuga, sadestatakse eetriga, tsentrifuugitakse ja seejärel pestakse eetriga 3 sekundit. ~5 korda saadi valge tahke aine. Pärast selle lahustamist puhtas vees, HPLC-ga soolatustage ja puhastage, külmutage{11}}kuivatage ja sadestage kristallid, tehke väike kogus MS-analüüsi.